AuNPs/RGO nanocomposite synthesize and characterization and investigation on its effects as mitoxantrone drug carrier in drug delivery on breast cancer therapy

سنتز نانوکامپوزیت AuNPs/RGO و بررسی خواص آن با تکنیک­های مختلف آنالیزی و تاثیر آن به عنوان حامل داروی Mitoxntrone در دارورسانی موضعی در درمان سرطان سینه

عباس جعفری­زاد ^*1،  سورنا قریبیان¹، ایوب آقانژاد²، آیدا اعظمی³، یدالله امیدی²

1-      دانشکده مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی سهند تبریز، ایران

2-      مرکز تحقیقات ریز فناوری نانو، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، ایران

3-      مرکز تحقیقات دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، ایران

تاریخ دریافت: 10/07/95              تاریخ تصحیح:19/09/95           تاریخ پذیرش: 24/10/95

چکیده

در این کار تحقیقاتی، ابتدا لینکر مرکاپتوپروپیونیک اسید به کمک معرف‌های N-هیدروکسی‌سوکسینیمید و DCCعامل دار گردید و سپس حد واسط حاصل با داروی  MTXمزدوج و مجموعه‌ی حاصل با نانوذرات طلا با اندازه‌ی  ۶نانومتر گونژوگه شدند و در نهایت، با گرافن اکسید احیا شده تبدیل به نانوکامپوزیت AuSMTX/RGOشدند. نانوذرات و نانوکامپوزیت‌های حاصل با استفاده از ، XRD، TEM، TGAآنالیز شدند و در نهایت آزمایشات in-Vitroدر حضور رده‌ی سلولی MCF7با انجام آزمایشات مختلفی از جمله،  MTT assayو  Flow cytometryو DAPI  Staining و Real time PCR تاثیر این نانوکامپوزیت برروی مرگ سلول‌های سرطانی مشخص شد.

واژگان کلیدی:  نانوذرات طلا، MTX، سرطان سینه، گرافن اکسید احیا شده، دارورسانی موضعی

1-  مقدمه

سرطان سینه شایع­ترین نوع سرطان در زنان در سراسر دنیاست که %23 از مجموع سرطان را به خود اختصاص داده­است [1-3]، که به دلیل محدودیت­ها و نواقص موجود در روش­های درمانی موجود از جمله جراحی، رادیوتراپی، شیمی­درمانی و ... منجر به مرگ­ومیر زنان در سراسر دنیا می­شود. [4و5]. داروهای هوشمند می­توانند با دقت بیشتری سلول­های سرطانی را هدف قرار دهند که درکل تاثیرات سمیت دارو کاهش یافته و ایمنی بیشتر را از لحاظ زیست تخریب پذیری برای بیماران فراهم می­کند [6].

از میان چندین نوع حامل­ دارو، نانوذرات طلا (AuNPs) با داشتن خواص منحصر به فردی از جمله خواص شیمی­فیزیکی، نوری، الکتریکی و مغناطیسی [7] به صورت موفقیت آمیزی در درمان سرطان­های پانکراس [8]، سینه [9]، مغز [10] و ... مورد تحقیق قرار گرفته­است. میتوزانترون (MTX) یکی از داروهای شیمیایی است که می­توان از آن در درمان سرطان­های سینه و مغز [11و12] بهره برد. به طور کلی، این دارو از رشد سلولی با منع topoisomerase II و به هم ریختن ساختار DNA و ترمیم و تشکیل آن جلوگیری می­کند و باعث مرگ Apoptosis سلول می­شود [3-5].

در این کار تحقیقاتی ابتدا نانوذرات طلا سنتز، سپس با لینکر مشخص داروها به نانوذرات Load شده و سپس به دلیل ارائه­ی نسبت سطح به حجم بالای گرافن اکسید احیا شده از آن برای Load بیشتر دارو استفاده شد. خواص نانوذرات مزدوج شده با دارو و همچنین نانوکامپوزیت به روش­های مختلف بررسی شدند و در آخر سمیت این گونه­ها سنجیده شد.

2-  بخش تجربی

2-1-  مواد

3-مرکاپتوپروپیونیک­اسید و N-هیدروکسی­سوکسینیمید و NوN-دی­سیکلوهگزیل­کاربونومید و گرافیت از Sigma-Aldrich (آمریکا) خریداری شدند و داروی میتوزانترون از Ebewe Pharma GmbH (اتریش) خریداری شدند. سرم RPMI 1640andfetal bovine از Invitrogene-Gibco (انگلستان) تهیه شد. مواد اولیه­ی Real time PCR (18srRNA, AKt, Caspase9, and Bax) از Eurofins MWG Operon (آلمان) خریداری شد. سایر مواد و وسایل از جمله Annexin V-FITC apoptosis detection kit ( EMD Chemicals- آمریکا) و The SYBR® Green PCR master mix ( Applied Biosystems – آمریکا) و سلول­های سرطانی MCF-7 از Pasteur Institute) – ایران) تهیه شدند.

2-2- روش­های سنتز

2-2-1- مزدوج ساختن نانوذرات طلا با دارویMTX

برای بدست آوردن رسوب AuSMTX مقدار ۱۰میلی‌لیتر از نرمال‌هگزان به محلول شامل مقدار مشخصی از داروی MTX  و نانوذرات طلا با اندازه‌ی ۱میلی‌لیتر افزوده شد و با ۵۰۰۰ دور بر دقیقه به مدت ۵دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس ۱۰ میلی‌لیتر دیگر از نرمال‌هگزان به جامدات جدا شده اضافه شد و دوباره سانتریفیوژ شد. در آخر نانوذزات بدست آمده‌ی  AuSMTXبا سیستم نرمال‌هگزان و کلروفرم به عنوان حلال سه بار شست‌و‌شو داده شدند.

2-2-2- سنتز نانوکامپوزیتAuSMTX/RGO

5 گرم گرافن اکسید احیا شده سنتز شده در ۱.۵ میلی‌لیتر حلال DMF حل و به مدت ۲ساعت سونیکیت شد و سپس دارو و نانوذرات با شکل   AuSMTXبه محلول اضافه و به مدت ۳ ساعت دیگر سونیکیت شد. سپس، محلول حاصل به لوله‌ی فالکون منتقل و با ۱۵ هزار دور بر دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل نانوکامپوزیت  AuSMTX/RGOبود.

2-3- آنالیزها و دستگاه­ها

   جهت بررسی طیف UV-vis از UV-Vis spectrophotometer (Jenway , United Kingdom)، برای بررسی سایز ذرات از دستگاه DLS با مشخصات Nanotrac Wave™ Microtrac, (San Diego, CA, USA) و بررسی کریستال سایز از D5000 X-Ray Diffractometer (Siemens, Munich, Germany) و بررسی طیف رامان توسط Bruker Dispersive Raman Spectrometer، برای بررسی مورفولوژی از Vega Tescan SEM analyzer (Czech republic) استفاده شد. همچنین برای مشخص ساختن سمیت گونه­های سنتز شده و مقاومت سلول­ها در برابر آن­ها از تست MTT ، تعیین نوع مرگ سلولی Apoptosisاز Flow cytometry، تشخیص مرفولوژی مرگ سلولی از نوع از DAPI staining استفاده شد.

3- نتیجه گیری

با ترکیب نانوذرات طلا با داروی MTX و پس از مشاهده­ی نتایج حاصل در بخش In-vitro (تجربی) می­توان گفت که:

1- سمیت سلولی افزایش یافته است.

2- هدف گیری گسترده­ی سلول­های سرطانی ممکن خواهد بود که می­تواند خواص ضد سرطانی آن را در کارهای تجربی (in-vitro) تحت تاثیر قرار دهد.

با اینکار نرخ نفوذ دارو به درون سلول­ها افزایش یافته است.

4- منابع

[1]Elstner, E., et al., Novel therapeutic approach: ligands for PPARγ and retinoid receptors induce apoptosis in bcl-2-positive human breast cancer cells. Breast cancer research and treatment, 2002. 74(2): p. 155-165.

[2]Kaabinejadian, S., et al., p53 expression in MCF7, T47D and MDA-MB 468 breast cancer cell lines treated with adriamycin using RT-PCR and immunocytochemistry. 2008.

[3]Loh, S.Y. and S. Chew, Awareness and practice of breast self examination among Malaysian women with breast cancer. Asian Pac J Cancer Prev, 2011. 12(1): p. 199-202.

[4]Di Leo, A., et al., New approaches for improving outcomes in breast cancer in Europe. The Breast, 2015.

[5]Jemal, A., et al., Global cancer statistics. CA: a cancer journal for clinicians, 2011. 61(2): p. 69-90.

[6]Dreaden, E.C., et al., Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic delivery, 2012. 3(4): p. 457-478.

[7]De Jong, W.H. and P.J. Borm, Drug delivery and nanoparticles: applications and hazards. International journal of nanomedicine, 2008. 3(2): p. 133.

[8]Torchilin, V., Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced drug delivery reviews, 2011. 63(3): p. 131-135.

[9]Cabral, H., et al., Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature nanotechnology, 2011. 6(12): p. 815-823.

[10]Patra, C.R., et al., Fabrication of gold nanoparticles for targeted therapy in pancreatic cancer. Advanced drug delivery reviews, 2010. 62(3): p. 346-361.

[11]Lee, J., et al., Gold nanoparticles in breast cancer treatment: Promise and potential pitfalls. Cancer letters, 2014. 347(1): p. 46-53.

[12]Hainfeld, J.F., et al., Gold nanoparticle imaging and radiotherapy of brain tumors in mice. Nanomedicine, 2013. 8(10): p. 1601-1609.